Am heutigen Standort der Katakomben von San Sebastiano befand sich in der Antike eine tiefe Senke, die als Puzzolane-Steinbruch diente und "Ad Catacumbas" genannt wurde (was so viel wie "bei den Höhlen" bedeutet). Diese Bezeichnungen wurde im Folgenden zum allgemeinen Synonym für einen unterirdischen Friedhof.
Seit dem 1. Jahrhundert wurde das Gelände intensiv genutzt und bebaut. Seine unterirdischen Galerien wurden umgewidmet, um Platz für Grabnischen zu schaffen, und an der Oberfläche wurden mehrere Kolumbarien und mindestens 2 Wohnbereiche (die "kleine Villa" und "große Villa") errichtet. Diese verfügen über bemerkenswerte gemalte Wanddekorationen.
Um die Mitte des 2. Jahrhunderts wurde die Mulde zugeschüttet, um einen freien Platz zu schaffen. Auf dessen einer Seite wurden nacheinander 3 Mausoleen errichtet (das Mausoleum von Clodius Hermes, das Mausoleum der Innocentiores und das Mausoleum der Axt).
Eine weitere Anhebung des Geländes erfolgte, um Raum für den Bau der Triclia zu gewinnen, eines Portikus, der von einer Mauer begrenzt wurde, auf der sich zahlreiche Graffiti befinden. Diese richten sich an Petrus und Paulus, die beide um das Jahr 250 an diesem Ort verehrt wurden.
An dieser Stelle ließ Kaiser Konstantin später (306-337) eine Basilika in Form eines römischen Zirkus (genannt "Circiforme") erbauen.
Im 3. Jahrhundert begann die unterirdische Entwicklung der Katakomben, die die Gräber der Märtyrer Sebastian und Eustachius beherbergten.